因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封鎖劑的作用。并非所有的人ELISA試劑盒固相均需封鎖，封鎖不當(dāng)反而會使陰性本底增高。脫脂奶粉也是一種良好的封鎖劑，其zui大的特點(diǎn)是價廉，可以高濃度使用（5%）?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封鎖劑使用，但因?yàn)槟谭鄣某煞輳?fù)雜，而且封鎖后的載體不易長期保留，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。封鎖的手續(xù)與包被相類似。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操縱時洗滌*，不經(jīng)封鎖也可得到滿足的結(jié)果。封鎖是否必要，取決于人ELISA試劑盒模式及詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)前提。封鎖(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保留數(shù)月。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。但在間接法測定中，封鎖一般是不可少的。
1、有的包被原可能不是蛋白，對于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被，我把方法扼要的列出如下：①親和素生物素：先親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法平均、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。②小分子必需依賴和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，人ELISA試劑盒這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識別，所以保留抗原很重要，我做重組蛋白時，師兄都嚴(yán)格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個道理。③脂類物質(zhì)：可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)天然干固在固相表面。
2、應(yīng)留意以下原理：因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用，這種物理吸附長短特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。包被液的選擇，一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時因?yàn)樵囼?yàn)的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包。詳細(xì)的試驗(yàn)還要有堅固的理論外也要實(shí)踐，看一下*可不可以應(yīng)用到自己試驗(yàn)當(dāng)中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
3、但*選用什么，要依據(jù)。常用封鎖劑有：0.05%-0.5%的BSA；10%的小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價廉，可以高濃度使用（5%－10％）；還有一些稀有用到的各種動物血清（主要為了排除相似蛋白干擾）和酪蛋白等等。封鎖就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些曠地空閑，從而排斥人ELISA試劑盒后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封鎖：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。
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